酵母雙雜交載體應(yīng)用中常遇到的問(wèn)題一是假陽(yáng)性較多，二是轉(zhuǎn)化效率偏低。所謂假陽(yáng)性就是:在待研究的兩個(gè)蛋白間沒(méi)有發(fā)生相互作用的情況下，報(bào)告基因被激活。
主要原因是由于BD融合誘餌蛋白有單獨(dú)激活作用，或者這種融合蛋白的激活作用被外來(lái)蛋白激活。另外AD融合靶蛋白如果有DNA的特異性結(jié)合，則也可單獨(dú)激活報(bào)告基因的表達(dá)。
因此，為排除假陽(yáng)性就需要作嚴(yán)格的對(duì)照試驗(yàn)。應(yīng)對(duì)誘餌和靶蛋白分別作單獨(dú)激活報(bào)告基因的鑒定。目前幾個(gè)公司推出的酵母雙雜系統(tǒng)都采用了多個(gè)報(bào)告基因，且每個(gè)報(bào)告基因的上游調(diào)控區(qū)各不相同，這可減少大量的假陽(yáng)性。
另外，報(bào)告基因通常整合到染色體上，可以使基因表達(dá)水平穩(wěn)定，消除了由于質(zhì)粒拷貝數(shù)變化引起基因表達(dá)水平波動(dòng)而造成的假陽(yáng)性。
即使根據(jù)嚴(yán)格的對(duì)照實(shí)驗(yàn)證明確實(shí)發(fā)生了蛋白間的相互作用，還應(yīng)對(duì)以下方面進(jìn)行分析:
(1)這種相互作用是否會(huì)在細(xì)胞內(nèi)自然發(fā)生，即這一對(duì)蛋白在細(xì)胞的正常生命活動(dòng)中是否會(huì)在同一時(shí)間表達(dá)且定位在同一區(qū)域。
(2)某些蛋白如是依賴(lài)于遍在蛋白的蛋白酶解途徑的成員，它們具有普遍的蛋白間的相互作用的能力。
(3)一些實(shí)際上沒(méi)有任何相互作用的但有相同的模體(motif)如兩個(gè)親a-螺旋的蛋白質(zhì)間可以發(fā)生相互作用。十年來(lái)，酵母雙雜交技術(shù)一直在消除假陽(yáng)性方面不斷改進(jìn)，并且已取得較好的效果〔2，3〕。
在酵母雙雜交的應(yīng)用中有時(shí)也會(huì)遇到假陰性現(xiàn)象。所謂假陰性，即兩個(gè)蛋白本應(yīng)發(fā)生相互作用，但報(bào)告基因不表達(dá)或表達(dá)程度甚低以至于檢測(cè)不出來(lái)
〔4〕。造成假陰性的原因主要有兩方面:
一、是融合蛋白的表達(dá)對(duì)細(xì)胞有毒性。這時(shí)應(yīng)該選擇敏感性低的菌株或拷貝數(shù)低的載體。
二、是蛋白間的相互作用較弱，應(yīng)選擇高敏感的菌株及多拷貝載體。目前假陰性現(xiàn)象雖不是實(shí)驗(yàn)中的主要問(wèn)題，但也應(yīng)予以重視。
轉(zhuǎn)化效率是酵母雙雜交文庫(kù)篩選時(shí)成敗的關(guān)鍵之一，特別是對(duì)低豐度cDNA庫(kù)進(jìn)行篩選時(shí)，必須提高轉(zhuǎn)化效率。
轉(zhuǎn)化時(shí)可采用共轉(zhuǎn)化或依次轉(zhuǎn)化，相比之下共轉(zhuǎn)化省時(shí)省力。更重要的是如果單獨(dú)轉(zhuǎn)化會(huì)發(fā)生融合表達(dá)蛋白對(duì)酵母細(xì)胞的毒性時(shí)，共轉(zhuǎn)化則可以減弱或消除這種毒性。一種更有效的方法是將誘餌蛋白載體與靶蛋白載體分別轉(zhuǎn)入不同接合型的單倍體酵母中，通過(guò)兩種接合型單倍體細(xì)胞的雜交將誘餌蛋白與靶蛋白帶入同一個(gè)二倍體細(xì)胞。